Y迷宮實(shí)驗(yàn)

Y迷宮實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)估小鼠的短期記憶。通過(guò)允許小鼠探索迷宮的所有三個(gè)臂，可以評(píng)估自發(fā)交替行為——一種空間工作記憶的測(cè)量，這是由嚙齒動(dòng)物天生想要探索以前未訪(fǎng)問(wèn)過(guò)的區(qū)域的好奇心驅(qū)動(dòng)的。一只具有完整工作記憶的小鼠，因此具有完整的前額葉皮質(zhì)功能，將記住以前訪(fǎng)問(wèn)過(guò)的臂，并傾向于進(jìn)入最近訪(fǎng)問(wèn)較少的臂?？臻g參考記憶，由海馬支持，也可以通過(guò)在訓(xùn)練期間將試驗(yàn)小鼠放入Y迷宮并關(guān)閉一個(gè)臂來(lái)測(cè)試。例如，在1小時(shí)的試驗(yàn)間隔后，小鼠應(yīng)該記得它以前沒(méi)有探索過(guò)的臂，并且應(yīng)該更頻繁地訪(fǎng)問(wèn)這個(gè)臂。本章描述了進(jìn)行這兩個(gè)相關(guān)測(cè)試并解釋結(jié)果之前的條件、所需材料和協(xié)議。

一、 引言

阿爾茨海默病是最常見(jiàn)的癡呆形式，其特點(diǎn)是認(rèn)知功能的逐漸衰退。據(jù)估計(jì)，它影響了超過(guò)60歲年齡組的6-8%的個(gè)體。臨床前的小鼠模型在測(cè)試癡呆和認(rèn)知障礙的潛在病理生理學(xué)以及篩選和開(kāi)發(fā)新藥治療方面已被證明是有用的。本章描述了兩種行為測(cè)試，用于檢測(cè)工作記憶和參考記憶，可以使用同一設(shè)備——一個(gè)封閉的Y迷宮來(lái)進(jìn)行。

基于其設(shè)計(jì)基礎(chǔ)，Y迷宮可用于評(píng)估小鼠的短期記憶。例如，自發(fā)交替，一種測(cè)量空間工作記憶的方法，可以通過(guò)允許小鼠自由探索迷宮的所有三個(gè)臂來(lái)評(píng)估，這種行為是由嚙齒動(dòng)物探索以前未訪(fǎng)問(wèn)過(guò)的區(qū)域的天生好奇心驅(qū)動(dòng)的。一個(gè)具有良好工作記憶的小鼠將記得它已經(jīng)訪(fǎng)問(wèn)過(guò)的迷宮的臂，并將傾向于進(jìn)入最近訪(fǎng)問(wèn)較少的臂。這需要大腦的幾個(gè)不同區(qū)域，如海馬和前額葉皮質(zhì)之間的互動(dòng)。測(cè)試是使用一個(gè)Y形迷宮進(jìn)行的，迷宮有三個(gè)淺色的、不透明的臂，它們以120°的角度相互定位。小鼠在迷宮上的特定位置引入，并允許在短時(shí)間內(nèi)自由探索臂。當(dāng)小鼠的所有四肢都在一個(gè)臂內(nèi)時(shí)，認(rèn)為發(fā)生了進(jìn)入臂的行為。交替定義為連續(xù)并且不重復(fù)的進(jìn)入所有三個(gè)臂。然后，記錄臂入口和交替的次數(shù)，以計(jì)算交替行為的百分比。高百分比被視為良好的工作記憶，因?yàn)檫@表明小鼠已經(jīng)回憶起它已經(jīng)訪(fǎng)問(wèn)過(guò)的臂。

空間參考記憶可以通過(guò)在訓(xùn)練期間將測(cè)試小鼠放入Y迷宮并關(guān)閉一個(gè)迷宮臂來(lái)測(cè)試（訓(xùn)練協(xié)議）。這個(gè)臂被為新穎臂。在一定的時(shí)間間隔（試驗(yàn)間隔，ITI）后，期間將小鼠從迷宮中移除，然后在移除障礙物后將小鼠重新放入迷宮（測(cè)試協(xié)議）。ITI的長(zhǎng)度將強(qiáng)烈影響動(dòng)物在這項(xiàng)任務(wù)中的表現(xiàn)，因?yàn)檩^長(zhǎng)的ITI需要更高的記憶負(fù)載。常用的小鼠品種通常在最多4小時(shí)的ITI下在這項(xiàng)任務(wù)中表現(xiàn)良好。一些研究者使用24小時(shí)的ITI來(lái)探索長(zhǎng)期空間記憶。小鼠應(yīng)該基于遠(yuǎn)端空間線(xiàn)索及其與Y迷宮中自己當(dāng)前位置的關(guān)系，記住它以前沒(méi)有探索過(guò)的臂，并且應(yīng)該比其他臂更頻繁地訪(fǎng)問(wèn)這個(gè)新穎臂。然后將進(jìn)入新穎臂的次數(shù)與進(jìn)入其他臂的次數(shù)進(jìn)行比較，以評(píng)估空間記憶的程度。在測(cè)試會(huì)議期間，對(duì)任何臂都沒(méi)有偏好的小鼠表示空間記憶受損，這可能表明海馬功能受損。

二、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)和對(duì)照小鼠（見(jiàn)注釋1）。

2.稱(chēng)重秤。

3.測(cè)試室及相鄰操作員座位的房間（見(jiàn)注釋2）。

4.淺灰色聚氯乙烯（PVC）Y形隔間（21 × 7 × 15.5厘米），三個(gè)臂長(zhǎng)相等（圖1）。

5.用來(lái)阻擋迷宮一臂的隔板。

6.迷宮周?chē)娜齻€(gè)視覺(jué)線(xiàn)索標(biāo)志物（見(jiàn)注釋3）。

7.容器裝Y迷宮，以防老鼠逃跑。

8.攝像頭/相機(jī)（見(jiàn)注釋4）。

9.支架用來(lái)將攝像頭放置在迷宮上方的較高位置。

10.visutrack行為學(xué)分析軟件（見(jiàn)注釋5）。

11.噴霧瓶裝有70%的乙醇和紙巾（見(jiàn)注釋6）。

三、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

1.實(shí)驗(yàn)前至少7天讓小鼠適應(yīng)，以便所有動(dòng)物熟悉房間、工作人員、氣味和噪音（見(jiàn)注釋7）。

2.在行為學(xué)研究的早上稱(chēng)量小鼠并記錄信息，包括研究標(biāo)題和小鼠品系。

3.使用乙醇噴霧瓶和紙巾確保Y迷宮在測(cè)試前清潔。

4.清潔后確保迷宮干燥。

5.將攝像頭放置在Y迷宮上方的支架上，并通過(guò)延長(zhǎng)USB線(xiàn)纜連接到電腦（見(jiàn)注釋8）。

6.在測(cè)試前1小時(shí)將小鼠放入行為測(cè)試室中，讓它們適應(yīng)條件。

四、 短期記憶的測(cè)試——自發(fā)性交替

1.標(biāo)記迷宮的三個(gè)臂為A、B和C。

2.讓行為學(xué)軟件與Y迷宮相機(jī)連接成功并調(diào)整清晰度，全面的拍攝到迷宮里的老鼠。

3.將測(cè)試動(dòng)物放置在標(biāo)有A的臂的遠(yuǎn)端，面向迷宮中心，輕輕地抓住尾巴的基部。

4.離開(kāi)測(cè)試室。

5.讓小鼠自由探索迷宮5/8/10分鐘。

6.停止錄像并保存文件。

7.將小鼠從迷宮中取出，放回原籠。

8.在進(jìn)行下一個(gè)動(dòng)物之前，清潔迷宮的所有墻壁和地面。

9.實(shí)驗(yàn)結(jié)束并測(cè)試了所有的小鼠后，將所有小鼠放回保持室中的家籠。

10.清潔所有設(shè)備并收拾好。

11.檢查視頻并記錄所有進(jìn)入臂的次數(shù)和交替次數(shù)（見(jiàn)注釋9）。

12.使用以下公式計(jì)算百分比（%）交替：

五、 空間參考記憶測(cè)試——新穎臂測(cè)試

1.小鼠適應(yīng)期后，如上述標(biāo)記迷宮的三個(gè)臂為A、B和C。

2.用隔板關(guān)閉其中一個(gè)臂（圖2）（見(jiàn)注釋10）。記錄哪個(gè)臂被關(guān)閉。

3.通過(guò)USB采集卡纜將攝像頭連接到電腦并開(kāi)始錄像（見(jiàn)注釋8）

4.將動(dòng)物面向中心放入一個(gè)開(kāi)放的臂中，并記錄動(dòng)物被放置在哪個(gè)臂（見(jiàn)注釋11）。

5.離開(kāi)行為測(cè)試室。

7.按下visutrack軟件的的開(kāi)始分析鍵，并計(jì)時(shí)15分鐘。

8.讓動(dòng)物自由探索迷宮15分鐘。

9.15分鐘后，停止錄像。

10.將測(cè)試小鼠返回其飼養(yǎng)籠。

11.移除隔板。

12.等待1小時(shí)（或預(yù)設(shè)的ITI所需的時(shí)間長(zhǎng)度）并再次開(kāi)始錄像。

13.用VisuTrack設(shè)置定時(shí)器為5分鐘。

14.將相同的測(cè)試小鼠放置在之前試驗(yàn)中使用的同一臂的遠(yuǎn)端，面向迷宮中心。

15.離開(kāi)測(cè)試室并按下定時(shí)器的開(kāi)始鍵。

16.讓動(dòng)物自由探索迷宮5分鐘。

17.停止錄像并保存文件。

18.將小鼠從迷宮中取出，放回家籠。

19.在進(jìn)行下一個(gè)動(dòng)物之前，清潔迷宮的所有墻壁和地面。

20.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將所有小鼠返回保持室，清潔所有設(shè)備并收拾好。

21.使用Visutrack軟件分析測(cè)試期間進(jìn)入所有臂的總行走距離。

22.識(shí)別迷宮的起點(diǎn)、新穎的臂和其他臂，并記錄每個(gè)臂的進(jìn)入次數(shù)以及在每個(gè)臂中停留的時(shí)間（見(jiàn)注釋12）。

六、注釋

1.選擇的小鼠種類(lèi)應(yīng)該能代表認(rèn)知或記憶障礙/增強(qiáng)的某個(gè)方面，例如慢性應(yīng)激模型、加速衰老的遺傳模型或潛在記憶增強(qiáng)藥物的測(cè)試。最重要的是，所有程序應(yīng)得到相應(yīng)機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。

2.使用單獨(dú)的房間很重要，因?yàn)樗钚』瞬僮髡吒深A(yù)或?qū)y(cè)試結(jié)果產(chǎn)生不當(dāng)影響的可能性。在此基礎(chǔ)上，測(cè)試期間設(shè)施內(nèi)的環(huán)境噪音應(yīng)盡量減少。同樣重要的是，動(dòng)物保持區(qū)域內(nèi)也應(yīng)滿(mǎn)足此條件，因?yàn)樵胍艨赡軙?huì)增加動(dòng)物的壓力水平，并導(dǎo)致認(rèn)知障礙。

3.這些可以是圓形和方形的圖片，用來(lái)幫助老鼠識(shí)別與新奇性相關(guān)聯(lián)的迷宮臂。確保作為遠(yuǎn)距離空間線(xiàn)索的物體在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不會(huì)移動(dòng)。

4.使用攝像頭是為了能遠(yuǎn)程觀察所有情況。同樣，這有助于最小化直接觀察者可能對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生的不當(dāng)影響。

5.用于分析動(dòng)物行為的軟件。也可以使用其他軟件，但操作者應(yīng)確保所需的輸出測(cè)量值包含在其特性中。

6.這僅僅是為了在測(cè)試運(yùn)行前和期間清潔迷宮，因?yàn)闅埩舻臍馕逗臀镔|(zhì)可能會(huì)影響測(cè)試結(jié)果。

7.同樣，這是所有行為學(xué)研究中應(yīng)采取的步驟，以減少動(dòng)物的壓力，從而提高研究結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。此外，至少在行為測(cè)試前24小時(shí)，設(shè)施內(nèi)不應(yīng)進(jìn)行動(dòng)物的淘汰或采血。在整個(gè)行為測(cè)試過(guò)程中應(yīng)保持低環(huán)境噪音。

8.在電腦屏幕上檢查圖像時(shí)，確?？梢钥吹矫詫m的所有區(qū)域。

9.如果老鼠用全部四只爪子進(jìn)入迷宮的一個(gè)臂（A、B或C），則記錄為一次進(jìn)入。交替定義為老鼠連續(xù)進(jìn)入所有三個(gè)臂。為了識(shí)別自發(fā)交替，使用了重疊技術(shù)。例如，A–C–B–C–A的模式包含兩次交替。

10.用于阻塞的臂應(yīng)隨機(jī)選擇，并在小鼠間輪換。

11.這也應(yīng)在不同的運(yùn)行和測(cè)試小鼠之間隨機(jī)化。

12.具有完整空間參考記憶的老鼠應(yīng)該進(jìn)入并在新奇臂中花費(fèi)的時(shí)間比迷宮的其他臂多。然而，我們和其他人注意到，小鼠在研究初期傾向于在起始臂逗留，因此這個(gè)臂可能被排除在比較基準(zhǔn)之外?？臻g參考記憶受損的小鼠將無(wú)法識(shí)別新奇臂，因?yàn)樗鼈儫o(wú)法回憶起在研究預(yù)運(yùn)行階段哪個(gè)臂被阻塞。記憶受損表現(xiàn)為對(duì)新奇臂和其他臂的區(qū)分缺失。